奧林巴斯倒置顯微鏡的工作原理是物體位于物鏡前方，離開物鏡的距離大于物鏡的焦距，但小于兩倍物鏡焦距。所以，它經物鏡以后，必然形成一個倒立的放大的實像A'B'。A'B'靠近F2的位置上。再經目鏡放大為虛像A''B''后供眼睛觀察。目鏡的作用與放大鏡一樣。所不同的只是眼睛通過目鏡所看到的不是物體本身，而是物體被物鏡所成的已經放大了一次的像。

  奧林巴斯倒置顯微鏡能夠輸出更明亮、反差更高的圖像，若經常使用，則每次用完后應用擦鏡紙蘸取少許的酒精對顯微鏡鏡頭進行清潔，并用抹布擦拭顯微鏡鏡身，確保干凈無灰塵。若長期不用，應每個月至少通電一次，并用上述方法用擦鏡紙對鏡頭進行清潔保養。